A traditional Chinese medicine formula extracts stimulate proliferation and inhibit mineralization of human mesenchymal stem cells in vitro

Aim of the study

To investigate the effects of a traditional Chinese medicine (TCM) formula extract, named as ZD-I, on the proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in vitro.

Materials and methods

When hMSCs cultivated in the basal medium with ZD-I, cell viability was assessed by MTT assay and cellular proliferation was assessed by SYBR green I assay. The effects of ZD-I on osteogenic differentiation of hMSCs were assessed by alkaline phosphatase (ALP) activity, mineralization assay and real-time RT-PCR.

Results

ZD-I (0.78–100 μg/ml) was non-cytotoxic. The 50% inhibitory concentration (IC50) of hMSCs was 200 μg/ml. ZD-I (0.78–50 μg/ml) stimulated the proliferation of hMSCs. ZD-I did not change ALP activity of hMSCs cultivated in osteogenic medium in the early stage (4 and 7 days), but ZD-I inhibited the mineralization of hMSCs through down-regulation of several osteogenic markers (e.g. osteocalcin, bone morphogenetic protein 2 and osteopontin) in the late stage.

Conclusions

ZD-I stimulate cellular proliferation and decrease the bone mineral deposition of hMSCs. These results suggest ZD-I may play an important therapeutic role in osteoarthritic patients by improving proliferative capacity of hMSCs and inhibiting the mineralization of hMSCs.     

封闭式负压引流术治疗人工关节置换术后深部感染

目的探讨采用封闭式负压引流术(vacuum sealing drainage,VSD)结合病灶清创治疗人工髋、膝关节置换术后深部感染的方法和疗效。方法 2006年9月-2010年5月,收治13例人工关节置换术后深部感染患者。男5例,女8例;年龄56～78岁,平均62.5岁。置换术后7 d～1年2个月发生感染,中位时间14 d;发生感染至入院时间为8 d～4年6个月,中位时间21 d。均见脓性或脓血性分泌物,5例形成窦道,8例切口、引流口未愈合。分泌物引流口或窦道口皮肤缺损范围为5 mm×3 mm～36 mm×6 mm;分泌物引流通道或窦道深度为21～60 mm。11例取组织行病理检查,提示10例为急性或慢性化脓性感染急性发作,1例为结核。6例取分泌物培养,提示5例金黄色葡萄球菌阳性,1例为阴性。彻底清创后,10例行白天冲洗和晚上持续VSD治疗;3例仅持续VSD治疗。结果 1例人工全髋关节翻修术者VSD治疗时出血较多,停止负压吸引并加压包扎,第3天再次行VSD无大量出血。患者均获随访,随访时间1年～4年5个月,平均2年11个月。10例患者经VSD治疗后7～75 d感染控制,平均43 d;假体均保留,无感染复发,创面愈合良好,疼痛缓解,关节功能良好。1例因负压区疼痛过敏难以忍受拒绝VSD治疗,感染控制无效行大腿中上段截肢;1例感染结核疗效不明显,取出假体后采用骨水泥填塞临时膝关节融合治疗;1例VSD治愈后9个月感染再复发,取出假体旷置、VSD治疗3周,1年4个月未复发。结论 VSD结合病灶清创术使深部创面引流充分,可促进创面愈合,降低感染复发率,最大程度保留假体。     

假体表面改性和材料纳米化对骨质疏松骨床中假体骨整合的影响*☆△

背景：羟基磷灰石涂层优化能够改善假体的早期和中期固定效果,但其远期固定效果差强人意。大量研究表明：羟基磷灰石涂层材料纳米化和假体表面改性可提高假体-骨界面的结合情况。但材料纳米化与表面改性和骨整合相关性如何国内外尚未见专门研究。 目的：对比骨质疏松条件下材料纳米化与表面改性对两类羟基磷灰石假体骨整合促进作用的差异。 设计、时间及地点：随机对照实验,分别于2007-09/12和2008-03/05在中山大学动物实验中心和香港大学医学院矫形外科组织学实验室完成。 材料：圆柱形多孔羟基磷灰石假体和光滑表面纳米羟基磷灰石假体由华南理工大学材料学院制作、提供,尺寸为3 mm×3 mm。 方法：将32只5月龄雌性SD大鼠按随机分为4组：假手术+多孔羟基磷灰石组,假手术+光滑表面纳米羟基磷灰石组,骨质疏松+多孔羟基磷灰石组,骨质疏松+光滑表面纳米羟基磷灰石组,每组8只。骨质疏松+多孔羟基磷灰石和骨质疏松+光滑表面纳米羟基磷灰石组大鼠切除卵巢建立绝经后骨质疏松动物模型。在各组大鼠胫骨上段分别植入多孔和光滑表面的羟基磷灰石假体。 主要观察指标：12周后处死大鼠,取带假体标本,运用骨组织计量学检测手段,测量假体周围骨的骨量及结合率等指标。 结果：①骨质疏松+多孔羟基磷灰石组骨结合率为23.7%,较骨质疏松+光滑表面纳米羟基磷灰石组高16.9%,差异具有显著性意义(P < 0.05)。②骨质疏松组在骨整合率上较假手术组显著降低,分别降低30.8%和13.0%。 结论：骨质疏松条件下,假体表面结构优化可显著提高假体-骨界面结合程度、促进假体骨整合。光滑表面的纳米羟基磷灰石假体未能发挥纳米级羟基磷灰石的优势;在影响骨整合方面就羟基磷灰石涂层来说,涂层表面改性可能比单纯涂层材料纳米化更重要。     

木瓜蛋白酶诱导大鼠膝早期骨关节炎软骨表面的电镜扫描

背景：木瓜蛋白酶注射建立骨性关节炎动物模型是用于骨关节炎防治研究的常用方法之一。 目的：观察木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射诱导大鼠膝早期骨关节炎进程中扫描电镜下软骨表面形态学变化。 方法：2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L左旋半胱氨酸按2∶1比例混匀,取0.15 mL注射至SD大鼠右膝关节腔诱导骨关节炎模型,左膝注射等量生理盐水为对照组,另取2只4膝不做处理为正常对照组,于注射后第2,4,6周后分别使用扫描电镜观察股骨内侧髁关节软骨表面形态学变化。 结果与结论：正常和对照组可见表面分布较均匀的浅坑。木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射2周后大鼠软骨表面出现凹凸不平,皱缩扭曲变形;4周表面变薄,局部出现小裂纹;6周出现深大裂纹,软骨缺损。提示2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L左旋半胱氨酸混合注射诱导的早期骨关节炎模型的时间节点可以定在4-6周。     

关节镜下自体腘绳肌腱重建膝关节前交叉韧带

目的：探讨关节镜下自体4股腘绳肌腱、生物可吸收挤压螺钉固定重建前交叉韧带（ACL）的临床效果。方法：31例经关节镜检查证实为前交叉韧带断裂的患者，男27例，女4例；年龄17～40岁，平均25岁。其中合并半月板损伤26例，合并局部软骨损伤3例，软骨Ⅰ～Ⅱ度退变16例。均于关节镜下行自体4股腘绳肌腱和软组织生物可吸收挤压固定螺钉重建ACL。术后对膝关节功能进行评定。结果：31例术后均未发生关节感染、血管神经损伤等严重并发症。30例获得随访，时间9-39个月，平均（19±9．0）个月，Lysholm膝关节功能评分从术前平均（54．6±16．6）分提高至随访时平均（92．5±5．7）分，较术前显著改善（t=11．84，P〈0．01）。30例患者中，26例恢复伤前运动水平，2例运动水平较伤前降低，2例因运动后出现关节酸痛而不敢剧烈运动。结论：关节镜下采用4股腘绳肌腱作移植物，生物可吸收挤压螺钉固定，是重建ACL的一种安全可靠的治疗方法。具有手术创伤少、术后膝关节功能恢复良好的优点。     

成骨不全一家系的COL1A1基因突变分析

目的探讨一个成骨不全家系的COL1A1基因的突变位点及其与临床特征的关系。方法收集一个成骨不全家系的临床资料，采用聚合酶链反应以及直接测序法对家系内成员进行COL1A1基因突变位点检测，同时对50名无血缘关系健康对照者的该位点进行限制性内切酶分析。结果该家系中成骨不全患者均存在COL1A1基因的第2461位点G→A突变（17．821S），但其临床特征不一致。而在家系内非患者及正常对照者中均未发现该突变。结论COL1A1基因突变是中国人群中成骨不全致病原因之一。成骨不全的表型不仅与基因型有关，还与遗传背景有关。     

重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人骨形成蛋白4（human bone morphogenetie protein4，hBMP-4）基因腺相关病毒载体。方法 根据hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入Sal Ⅰ位点，以EX-A0242M01hBMP4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中，获得重组质粒pUCl8hBMP-4。然后用EcoRⅠ与Sal Ⅰ酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV，回收酶切片段，T4DNA连接酶16C过夜，转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞，筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4，EcoRⅠ／SalⅡ双酶切鉴定，并行全基因测序。转染BHK21细胞，G418筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HsV1-rc／△UL2感染，包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度，SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果 PCR电泳及酶切鉴定表明，pSNAV-hBMP-4重组成功，基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确；AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1．5×10^12μg／ml，分泌蛋白浓度为0．124mg／ml，病毒载体纯度在95％以上。结论 实验获得的病毒载体滴度高、感染性好，可以满足骨组织工程的需要。     

含聚乳酸-羟基乙酸共聚物的新型磷酸钙骨水泥体内降解性能研究

目的探讨含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)的新型磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)(CPC/PLGA)体内降解性能,为临床试验奠定基础。方法按照45%磷酸氢钙、45%部分结晶磷酸钙、10%PLGA比例,制备CPC/PLGA。健康成年新西兰兔32只,体重2.2～3.0 kg,雌雄各半;随机分为CPC/PLGA组(实验组,n=17)及CPC组(对照组,n=15)。两组实验动物制备双侧股骨内侧髁直径4.5 mm、深1.5 cm骨缺损模型,右侧骨缺损分别采用CPC/PLGA及CPC修复,左侧不作处理作为空白对照。术后观察实验动物一般情况,术后2、4、8、16、24周两组取材行组织学观察、骨形态计量学分析,术后8周及16周实验组取材行扫描电镜观察。结果实验动物均存活至实验结束。组织学观察显示,随时间延长,实验组CPC/PLGA逐渐降解,并有新生骨小梁从边缘长入其中,并且增粗、增长,24周时材料基本降解,被新生骨小梁取代;对照组CPC降解明显较实验组延迟。实验组术后总骨组织含量百分比为44.9%±23.7%,显著高于对照组的25.7%±10.9%(t=3.302,P=0.001);实验组术后4周骨组织含量百分比与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),8、16、24周均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜观察结果显示,实验组术后8周CPC/PLGA降解后形成孔径为100～300μm孔隙;随着时间延长,16周时新生骨小梁长入孔隙内,并与残余骨水泥牢固结合。结论 CPC/PLGA植入兔体内后具有良好的降解性能,有望成为一种良好骨移植材料。